ВведениеОбследование, лечение и медицинская реабилитация при злокачественных новообразованиях (ЗНО) являются социально значимыми видами медицинской деятельности [1]. Наибольший удельный вес в современной структуре онкологической заболеваемости женского населения в России имеют ЗНО органов репродуктивной системы (39,2%) -  рак молочной железы (РМЖ) и рак яичников (РЯ) занимают соответственно 1-е и 5-е место как по заболеваемости, так и среди онкологической смертности у женщин [2]. РМЖ и РЯ являются основными причинами смерти у женщин в возрасте 40-49 и 50-59 лет.  Согласно современным взглядам, РМЖ не является единообразным заболеванием и включает несколько биологических подтипов, которые могут быть надежно определены с использованием методов генетического тестирования или иммуногистохимического анализа (ИГХ). Более того, подходы к планированию терапии уже основаны на четком распознавании биологических подтипов, а рекомендации по системной противоопухолевой терапии сегодня определяются молекулярной классификацией РМЖ [3]. РЯ также характеризуется разнообразием молекулярно-генетических нарушений, которые коррелируют с клиническими и морфологическими данными [4-5].В ряде случаев (до 20%) РМЖ и РЯ предстают как наследственное заболевание, связанное с ролью генов BRCA1 и BRCA2 (breast cancer 1 и breast cancer 2  - гены, ассоциированные с раком молочной железы). Впервые эти гены были открыты в США в 1994 году, участвуют в процессе восстановления молекулы ДНК при двунитевых разрывах (поддержание стабильности генома) и функционально относятся к генам-онкосупрессорам. BRCA-ассоциированный риск развития опухоли наследуется по аутосомно-доминантному принципу от одного из родителей, который передает наследуемый (герминальный) мутантный вариант гена. Аналогичное значение имеют герминальные мутации в гене CHEK2 (checkpoint kinase 2 -  протеинкиназа контрольной точки 2 типа), который также относится к генам-онкосупрессорам и участвует в регуляции клеточного цикла при двунитевых повреждениях ДНК. Функция белка Chk2 тесно связана с белком BRCA1, p53 и другими онкосупрессорными молекулами. Несмотря на существование других генов-онкосупрессоров (PTEN, ATM, TP53), наиболее востребованной и значимой на сегодняшний день остается генетическое тестирование BRCA1/2 и CHEK2 с целью выявления наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ.Описано около 200 мутаций в– генах BRCA, биологический смысл существенной части (≥38%) из них остается неизученным и не может быть рекомендован для клинического обследования [6]. Благодаря исследованиям российских ученых, определен набор герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2, наиболее распространенных в российской популяции и имеющих доказанную клиническую значимость [7]. Цель исследования: оценить частоту распространенности мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 у больных РМЖ и РЯ, а также в популяции женщин, страдающих доброкачественными новообразованиями молочных желез, и проанализировать их клинико-морфологические корреляции с характеристиками заболеваний в рутинной клинической практике врача-онколога амбулаторного звена. Материалы и методы.В исследование были включены 76 женщин, наблюдающихся у онколога КДЦ ГВКГ им. академика Н.Н. Бурденко (г. Москва) на протяжении 2016 – 2019 годов, которые были разделены на три группы. У всех женщин было получено письменное информированное согласие об участии в исследовании (обязательный критерий включения), дизайн исследования был одобрен Локальным этическим комитетом ФГБУ «ГВКГ им. академика Н.Н. Бурденко».Первые две группы составили больные, страдающие РМЖ (n=20) и РЯ (n=17), средний возраст у которых на момент манифестации заболеваний был 49,5 ± 12,2 лет (диапазон 23 – 69 лет) и 58,2 ± 12,1 лет (диапазон 31 – 80 лет) соответственно. Диагноз у всех пациенток был гистологически подтвержден, степень злокачественности опухоли определялась согласно критериям Ноттингемской классификации в модификации по Элстону и Эллису (для РМЖ) [8] и Международной гистологической классификации ВОЗ (для РЯ) [9]. Статус рецепторов эстрогенов и прогестерона, Her2/neu и индекса Ki-67 в опухоли определяли с использованием стандартных методов иммуногистохимического анализа. У одной женщин был первично-множественный метахронный рак молочной железы и яичников. В контрольную группу были включены 40 женщин с доброкачественными новообразованиями молочных железы (фиброзно-кистозной мастопатией: n=29, фиброаденомой: n=11), не имеющие в анамнезе перенесенные онкологические заболевания какой-либо локализации (критерий исключения). Средний возраст женщин в этой группе на момент проведения исследования составил 49,1 ± 14,4 лет (диапазон 22 – 73 лет). Во всех трех группах была проведена ДНК-диагностика герминальных патогенных мутаций 185delAG, 300T>C (Cyse61Gly), 2080delA, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 4153delA, 5382InsC в гене BRCA1, мутации 6174delT в гене BRCA2 и мутаций IVS2+1G>A, I157T и IVS2+1G>A в гене CHEK2 с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (набор реагентов ОнкоГенетика, компании ДНК-Технология, Россия; регистрационное удостоверение МЗ СР РФ №ФСР 2010/08415). Диагностическая чувствительность данного метода составляет 100% (95% доверительный интервал (ДИ): 93,9-100%), диагностическая специфичность – 100% (95% ДИ: 99,6-100%) Материалом для генотипирования служила ДНК, выделенная из клеточных ядер лимфоцитов периферической крови обследуемых. В случае обнаружения мутации дополнительным методом подтверждения было проведение секвенирования ДНК кодирующей части указанных генов. Молекулярная диагностика выполнялась на базе четырех лабораторий: в лаборатории эпигенетики ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», в Центре молекулярной диагностики CMD Центрального НИИ Эпидемиологии и в медицинской лаборатории «Гемотест».Статистическую обработку материалов исследования проводили с помощью пакета специализированных прикладных программ SPSS Statistics (IBM Corp., США) версии 22. Для нахождения различий между качественными показателями у обследованных женщин различных групп применяли точный критерий Фишера. Для оценки различий числовых данных в группах при нормальном виде распределения применяли метод параметрической статистики (t-критерий Стьюдента), при отсутствии нормального распределения данных использовали методы непараметрической статистики (U-тест Манна–Уитни). Статистически значимыми считали различия при р <0,05 (95 % уровень значимости). Результаты При генотипировании BRCA1 76 обследуемых стандартным методом значимые мутации выявлены у 7 (9,2%) женщин – 4 (20%) больных РМЖ, 3 (17,6%) больных РЯ и у 1 (2,5%) женщины с фиброаденомой молочной железы. Среди носителей мутантного гена BRCA1 была пациентка с первично-множественными метахронными злокачественными новообразованиями молочной железы и яичников. Наиболее распространенной была мутация 5382insC в гетерозиготном состоянии (5/7, 71,4%), реже обнаруживались «делеторные» мутации 3875delGTCT и 2080delA в гетерозиготном состоянии (по одному случаю, 14,3%). Мутации в гене BRCA2 были обнаружены у 3 (3,9%) женщин – 2 (10%) в группе РМЖ и 1 (2,5%) с фиброаденоматозом молочных желез. В группе больных РЯ не отмечено случаев наследования мутации 6174delT.Мутации в гене CHEK2 были выявлены у 3 (4%) женщин и только в группе больных РМЖ (15%). Все случаи были представлены мутацией I157T в 4 экзоне гена CHEK2 в гетерозиготном состоянии. В контрольной группе женщин с доброкачественными новообразованиями все случаи мутаций BRCA1 и BRCA2 (n=2) были ассоциированы с развитием фиброаденомы молочных желез в молодом возрасте до 30 лет. Случаев мутаций у женщин с фиброзно-кистозной мастопатией не обнаружено.Риск носительства мутаций в генах BRCA и CHEK2 оказался значимо выше в группе больных раком молочной железы (45%, ОР 9,0, 95% ДИ: 2,14 – 37,8) по сравнению с контрольной группой женщин с доброкачественными новообразованиями молочных желез (5%, p < 0,001). В то же время в группе больных раком яичников риск носительства мутаций был также выше (17,6%, ОР 3,53, 95% ДИ: 0,65 – 19,26), чем в контрольной группе (5%), но различие не достигло достоверных различий (p = 0,151).Результаты генотипирования BRCA и CHEK2 прямо коррелировали (r = 0,423) с семейным анамнезом: мутации чаще выявлялись у женщин с семейной отягощенностью онкологическими заболеваниями (42,9%), чем у женщин, чьи родственники не страдали онкологическими болезнями (7,3%). Риск выявления мутаций был значимо выше при наличии положительного семейного анамнеза (ОР 5,88, 95% ДИ: 2,03 – 17,24, p = 0,001), чем при отсутствии анамнеза. Обнаружены существенные различия и в структуре семейной отягощенности в зависимости от результатов генотипирования (рисунок 1): у носителей мутаций чаще преобладал семейный анамнез РМЖ и РЯ, в то время как для носителей дикого типа был характерным анамнез других онкологических заболеваний (преимущественно, рака легкого). № 1Рак молочной железыBreast Cancer № 4Гепатоцеллюлярная карциномаHepatocellular Carcinoma№ 7Рак почки Kidney Cancer№ 2Рак яичниковOvarian Cancer№ 5Рак толстой кишкиColon Cancer№ 8Рак мочевого пузыряBladder Cancer[DK1] № 3Немелкоклеточный рак легкогоNon-Small Cell Lung Cancer№ 6Рак тела маткиUterine Neoplasms№ 9ОтсутствуетNone [DK1]Рисунок 1. Сравнительная характеристика структуры семейной отягощенности онкологическими заболеваниями у женщин с мутациями (А) и диким типом (Б) генов BRCA и CHEK2.Figure 1. Comparison of the family history of cancer in women patients with mutated (A) and wild type (Б) BRCA and/or CHEK2 genes.Средний возраст манифестации РМЖ и РЯ оказался значимо более молодым у носителей мутаций в генах BRCA и CHEK2 (44,4 ± 15,0 лет, диапазон 23 – 69 лет), чем у женщин без выявленных мутаций (56,9 ± 11,0 лет, диапазон 26 – 80 лет, p = 0,015).  У пациенток с мутантными генами BRCA и CHEK2 средний возраст манифестации РМЖ был 42,4 ± 14,6 лет, возраст манифестации РЯ – 47,0 ± 18,7 лет. Сравнение возраста выявления РМЖ и РЯ в зависимости от генотипа BRCA и CHEK2 представлено на рисунке 2.У женщин с выявленными мутациями наблюдался повышенный риск раннего развития онкологических заболеваний в возрасте до 50 лет (69,2%, ОР 4,33, 95% ДИ: 1,64 – 11,36, p = 0,003) по сравнению с носителями дикого типа генов BRCA и CHEK2 (16%).   Рисунок 2. Возраст манифестации онкологических заболеваний (рака молочной железы и рака яичников) у женщин в зависимости от результатов генотипирования BRCA и CHEK2. Figure 2. Age at diagnosis of oncological diseases (breast cancer and ovarian cancer) in women by BRCA and CHEK2 genotype. Единственный случай первично-множественных метахронных злокачественных опухолей молочной железы и яичников был ассоциирован с носительством мутации в гене BRCA1. Риск билатерального опухолевого поражения молочных желез наблюдался только у женщин с выявленными мутациями в гене BRCA2 и не обнаруживался у пациенток с диким типом BRCA/CHEK2.Частота распространенности форм опухоли с высокой степенью злокачественности была выше среди больных с мутациями BRCA и CHEK2 (63,6%, ОР 2,45, 95% ДИ: 0,87 – 6,90), чем с диким типом генов (47,1%), однако различие не достигло достоверной значимости (p = 0,141). Случаи гормон-рецептор-негативных опухолей молочных желез наблюдались вне зависимости от генотипа BRCA и CHEK2: с одинаковой частотой отмечены в группе носителей мутаций (11,1%, случай «трижды негативного» РМЖ у больной с мутацией 5382insC в гене BRCA1) и в группе носителей дикого типа генов (9,1%). Обсуждение результатовПо результатам нашей работы можно сделать целый ряд выводов, имеющих важное практическое значение. Во-первых, в нашей работе обнаружена высокая распространенность мутаций в генах BRCA и CHEK2 при рутинном обследовании группы больных РМЖ и РЯ, в отличие от женщин с доброкачественными новообразованиями молочных желез. Известно, что распространенность мутаций генов BRCA1/2 в популяции здорового населения сильно различается в зависимости от исследуемой этнической группы (от 1/40 до 1/1000 в Северной Америке) [10-11]. Ранее проведенные российские исследования наглядно демонстрируют генетическую неоднородность РМЖ и РЯ с превалированием мутаций в генах BRCA1/2 (от 23% при РЯ до 33% при РМЖ) и CHEK2 (до 5% при РЯ) [4, 7]. Преобладают мутации 5382insC в гене BRCA1 и мутации I157T в гене CHEK2, что полностью совпадает с данными нашего наблюдения.Во-вторых, как показало наше исследование, вероятность обнаружения мутаций существенно возрастала (в 5 раз) при наличии семейной отягощенности онкологическими заболеваниями. Прицельный опрос женщин об онкологической заболеваемости у их кровных родственников может служить эффективным маркером для принятия решения о целесообразности генетического тестирования.В-третьих, нами убедительно продемонстрирована связь между носительством мутаций и ранним началом заболеваний (в возрасте до 50 лет). По нашим данным, средний возраст манифестации РМЖ и РЯ у носителей мутаций составил 42,4 и 47,0 лет, в то время как у женщин без мутаций составил 56,9 лет. Для сравнения: по данным Минздрава России, средний возраст впервые установленного диагноза в 2017 году был 61,4 лет (для РМЖ) и 59,3 лет (для РЯ) [12]. Таким образом, тактика лечения РМЖ и РЯ существенно отличается в зависимости от генотипа BRCA и CHEK2: среди носителей мутаций очевидно будет более востребованным и значимым сохранение репродуктивного здоровья и восстановление трудоспособности, чем у женщин без мутаций.В нашем исследовании обнаружена группа повышенного риска - у 2 женщин с выявленными мутациями BRCA в возрасте моложе 30 лет обнаружены фиброаденомы молочной железы, что требует регулярного проведения профилактического обследования. По данным исследований The Breast Cancer Linkage Consortium [13], накопленный риск развития РМЖ для носителей мутаций в генах BRCA1/2 к 80 годам достигает 80–85 %, в гене CHEK2 — 37 %.И, наконец, в-четвертых, наше наблюдение показывает, что наличие BRCA- и СHEK2-ассоциированных РМЖ и РЯ сопряжено с неблагоприятными характеристиками онкологических заболеваний – преобладанием опухолевых форм с высокой степенью злокачественности, метахронным поражением яичников/молочных желез и риском двухстороннего поражения органов. По данным Eerola и соавт., гормон-рецептор-негативный статус опухолей (к эстрогену, прогрестерону) и Her2/neu-негативный статус также чаще обнаруживаются у больных с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 [14]. В нашем наблюдении мы отметили случай «трижды негативного» РМЖ у носителя мутации в гене BRCA1. Случаи первично-множественного метахронного рака и билатеральных опухолей были зарегистрированы только у женщин с мутациями в генах BRCA1/2. К аналогичным выводам приходят и зарубежные исследователи: по данным Robson и соавт., 5-летний риск развития рака контрлатеральной РМЖ у женщин, заболевших до 42 лет, достигает 31% [15], по данным Graeser M.K., кумулятивный риск развития контрлатерального РМЖ в течение 25 лет после установления первичного диагноза РМЖ у носителей мутаций достигает 47,4%, причем оказывается еще в 1,6 раза выше при мутации в гене BRCA1. Обнаружена закономерность: в случае манифестации первичного РМЖ у носителя мутации в возрасте до 40 лет, 25-летний риск контрлатерального РМЖ составляет уже 62,9% и не превышает 20% в случае первичного заболевания, установленного после 50 лет [16]. Согласно современным представлениям, не только РМЖ и РЯ связаны с генотипом BRCA и CHEK2, но и ряд других онкологических заболеваний (табл. 1), причем как у женщин, так и у мужчин [17-18]. Для мужчин предложен риск-ориентированный подход к ПСА-скринингу, учитывающий семейный анамнез РМЖ и РЯ, рака предстательной железы (РПЖ) и поджелудочной железы [17].Таблица 1. Синдромы, ассоциированные с наследственным раком молочной железы [18-19]. Table 1. Various syndromes associated with hereditary breast cancer [18-19]СиндромSyndromeГеныGeneКлинические проявленияClinical manifestationСиндром наследственного рака молочной железы и/или яичниковHereditary Breast and Ovarian Cancer syndromeBRCA1,BRCA2РМЖ, РЯ, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, меланома, рак толстой кишкиBreast Cancer. Ovarian Cancer. Prostate Cancer. Pancreatic Adenocarcinoma. Melanoma. Colon CancerСиндром Ли-ФраумениLi-Fraumeni syndromeCHEK2,TP53РМЖ, мягкотканные саркомы, остеосаркомы, опухоли головного мозга, рак щитовидной железы, лейкозы, адренокортикальный ракBreast Cancer. Soft Tissue Sarcoma. Osteosarcoma. Brain Tumor. Thyroid Carcinoma. Hodgkin Lymphoma. Adrenocortical CarcinomaСиндром Луи-БарLouis-Bar syndromeATMЛимфома, мозжечковая атаксия, глиома головного мозга, поражения кожи, иммунодефицит, медуллобластома, РМЖLymphoma. Cerebellar atrophy with ataxia. Glioma. Cutaneous telangiectasias. Immune deficiency. Medulloblastoma. Breast Cancer    Синдром Линча (наследственный неполипозный рак толстой кишки)Lynch syndrome (often called Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer)MSH2, MSH3,MSH6,MLH1,PMS1,PMS2Рак толстой кишки, первично-множественные злокачественные опухоли: рак тела матки, яичников, молочной железы, желудка, тонкой кишки, мочеточника/почечной лоханки, желчных путей; сочетание с опухолями головного мозга (синдром Тюрко) или множественными аденомами сальных желез (синдром Торре)Colon Cancer, Malignant neoplasms of independent (primary) multiple sites:  Uterine Cancer, Ovarian Cancer, Breast Cancer, Stomach Cancer, Small Bowel Adenocarcinoma, Upper Urinary Tract Cancer, Bile Duct Cancer;Turcot syndrome (formation of multiple benign polyps in the colon that occur in association with a primary Brain Tumor).Muir-Torre syndrome (Colon Cancer in association with Sebaceous (oil gland) Skin tumors)Наследственный диффузный ракHereditary Diffuse Gastric Cancer syndromeCDH1Рак желудка, дольковый РМЖStomach Cancer. Lobular Breast CancerСиндром Пейтца-ЕгерсаPeutz-Jeghers syndromeSTK11Пигментация кожи, слизистых оболочек ротовой полости, множественные гамартомы ЖКТ, РМЖ, герминогенные опухолиHyperpigmented macules on the skin and oral mucosa (melanosis). Multiple hamartomatous polyps in the gastrointestinal tract. Breast Cancer. Germ Cell TumorsСиндром Коудена (синдром множественных гамартом)Cowden syndrome (often called Multiple Hamartoma Syndrome)PTENПоражение слизистых оболочек и кожи, множественные гамартомы (преимущественно в ЖКТ), РМЖ, рак щитовидной железы, опухоли маткиCharacteristic lesions on the mucosa and skin. Multiple hamartomas in the gastrointestinal tract. Breast Cancer. Thyroid Carcinoma. Uterine NeoplasmsАнемия ФанкониFanconi anemiaBRIP/FANCJ,PALB2/FANCN,FANCAАпластическая анемия, аномалии костей скелета, неврологические нарушения, врожденные пороки сердца, РМЖAplastic anemia. Skeletal abnormalities. Neurological disorders. Congenital defects of the heart. Breast CancerСиндром хромосомной нестабильностиChromosome fragility syndrome (often called The Nijmegen Breakage Syndrome)  NBS1Микроцефалия, первичный иммунодефицит, повышенная чувствительность к радиоактивному излучению, РМЖMicrocephaly. Primary immune deficiency. Hypersensitivity to radiation. Breast cancer ЗаключениеПолученные нами результаты свидетельствуют об актуальности и значимости выявления в рутинной клинической практике BRCA- и CHEK2-ассоциированных форм заболеваний у женщин с РМЖ и РЯ. Подавляющее большинство случаев заболеваний у носителей мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 обнаруживается в трудоспособном и репродуктивном возрасте женщин и сопряжены с неблагоприятными характеристиками – высокой степенью злокачественности и меньшей выживаемостью.